FSHW 反义置换探针:用于小分子核酸适体解离平衡常数测定的DNA条形码
时间: 2023-04-25 08:31:00 | 作者: OB体育注册
食物安全问题是联系到大众健康的严重问题,包含食源性致病微生物污染、毒素发生、抗生素乱用、食物添加剂过度运用、重金属离子污染、农兽药残留和有害物质不合法添加等。快速、活络、牢靠的食物有害物质检测关于食物安全的防控具有极端严重的含义。核酸适体作为一种能够与靶标高亲和力、高特异性结合的单链核酸,是辨认食物有害物质极具吸引力的东西,在食物安全检测新技能的开发和运用中发挥着重要作用。
可是,用于表征小分子-核酸适体亲和力的办法仍遭到质量敏感性或巨细差异才能的约束。这极大地阻止了小分子核酸适体的功用剖析以及其在食物安全检测和生命科学中的运用。因而,一些新的办法被规划和展开用来丈量小分子与核酸适体之间的亲和力,包含微阵列剖析、亲和层析和等度洗脱等。可是这些办法都需求对靶标分子或许核酸适体进行固定,所得亲和力和实践游离状况有所差异。根据DNA条形码的链置换战略为小分子-核酸适体相互作用的丈量供应了一种代替方案。
合肥工业大学食物与生物工程学院博士研讨生王磊、副研讨员毛瑜*、研讨员郑磊*等在文中提出了一种竞赛相互作用双平衡系统(CIDES)来评价在环境条件下无固定化的小分子-核酸适体的解离平衡。其间,核酸适体被反义置换探针(DNA条形码)部分阻断,这种丈量依赖于DNA条形码的靶标诱导置换,以及在溶液中反响后构成的靶标-核酸适体复合物和DNA条形码的定量。作者对典型小分子的核酸适体-ATP核酸适体进行了研讨,证明了该办法的可行性。进一步经过黄曲霉毒素B1(AFB1)及其核酸适体证明了该办法的普遍性。该竞赛解离平衡常数cKd方程供应了更合理和精确的非线性曲线回归模型,使得其可能在小分子核酸适体评价的未来展开中发挥重要作用。
文章中提出了根据猝灭基团符号的反义置换探针(Q-antisense DNA)和靶标与荧光符号核酸适体(F-aptamer)的竞赛相互作用而更新的cK d 方程模型。CIDES规划根据两个试验块。
式中,[F-aptamer]0是一切方式核酸适体的总浓度,[F-aptamer]是未杂交核酸适体的浓度,[Q-antisense DNA]对错杂交Q-antisense DNA的浓度,[Duplex]是核酸适体-反义DNA双链的浓度,F0是只要核酸适体时的总荧光强度,F是参加反义DNA后的剩下荧光强度。
式中,F0是只要核酸适体时的总荧光强度,F是参加反义DNA后的剩下荧光强度,[Target]是靶标的浓度,[Q-antisense DNA]是Q-antisense DNA的总浓度, [F-aptamer]0是一切方式核酸适体的总浓度,[F-aptamer]是未杂交核酸适体的浓度,cKd是竞赛解离平衡常数,n是一个核酸适体结合靶标的数量,IC50 = Kd[Q-antisense-DNA]/Kd’,Kd是解离平衡常数。
图3给出了必定份额下的F-aptamer、Q-antisense DNA(Q-ATP-n)和ATP相结合,以及相互竞赛的试验。成果表明,当挑选Q-ATP-11时,靶标更容易与核酸适体结合,将其从Q-antisense DNA,也便是DNA条形码上竞赛下来,并挑选运用Q-ATP-11进行后续试验。
运用不同份额的Q-ATP-11和F-aptamer([Q-ATP-11] 0 /[F-aptamer] 0 )结合后参加一不同浓度ATP后的荧光改变。发现在相同浓度的F-aptamer([F-aptamer] 0 )下,IC 50 跟着[Q-ATP-11] 0 /[F-aptamer] 0 的添加而逐步添加(图5)。这很可能是跟着系统中[Q-ATP-11] 0 的添加,靶标与核酸适体之间的结合被按捺的原因。为了满意靶标和核酸适体之间更多结合的需求,有必要添加更多的靶标,以便取得更大的IC 50 ,因而直接将IC 50 作为平衡离解常数是不牢靠的,有必要考虑反义DNA的参加对平衡解离常数的影响。
图6显现了经核算得到的cKd。成果表明,在[Q-ATP-11]0/[F-aptamer]0的条件相同的情况下,不同适体浓度的cKd类似,且跟着反义DNA浓度的逐步添加,cKd变得越来越挨近实在Kd。此外,反义DNA的浓度不能无限添加,由于跟着反义DNA浓度的添加,取得的cKd逐步趋于渠道化。因而,在测定Kd的试验中,当系统的荧光强度趋于陡峭时,能够运用该浓度的反义DNA,也能够运用该浓度的反义DNA来测定cKd。
挑选黄曲霉毒素B1和其核酸适体对此亲和力测定办法进行验证。成果显现,Kd’为(30.49±1.18) nmol/L,IC50为(506.22±129.97) nmol/L,终究核算的cKd为21.22 nmoL/L,与文献报导的透析法测得的Kd值挨近(图7)。这表明该办法具有较高的通用性。
综上所述,该文报导了一种使用核酸适体和与其部分互补的反义核酸,有用取得核酸适体-小分子复合物平衡解离常数的办法。这一战略是在靶标以及核酸适体自在状况下进行的,避免了固定化过程中的构象重排和核酸适体与靶标相互作用的扩散约束。此外,该办法具有操作简洁、成本低、特异性好等长处,对小分子核酸适体的挑选和运用具有重要含义。
王磊,男,合肥工业大学食物科学专业博士研讨生,首要从事食物安全与检测范畴的研讨工作。
毛瑜,女,合肥工业大学食物与生物工程学院食物质量与安全系副研讨员,近年来一向致力于研讨功用核酸相关的化学生物学、剖析化学以及纳米生物传感,在功用核酸的体外进化、生物传感器的构建及运用等范畴取得了多项高水平研讨成果,在高水平国内外期刊宣布学术论文20余篇,授权国家发明专利4项。掌管国家自然科学基金、国家要点研制方案子课题、安徽省自然科学基金等科研项目。
郑磊,博士/研讨员,博士生导师,现任合肥工业大学校长,“黄山学者”特聘教授、“食物安全”中青年立异集体带头人。本科及硕士、博士均结业于我国科学技能大学,“郭沫若奖”取得者。首要从事食物安全剖析检测、肠道养分健康研讨,以及物质科学与生命科学穿插范畴的研讨工作,掌管国家要点研制方案“食物安全要点专项”项目“粮油食物供应链损害物辨认与防控技能研讨”等项目十余项,以榜首完成人获省部级科技奖赏一等奖1项、三等奖1项,参与制修订国家规范6项,宣布高质量论文100余篇。辅导的研讨生获安徽省“互联网+”大学生立异创业大赛金奖和全国“研讨生才智城市技能与创意规划大赛”优胜奖。
为构建多元化食物供应系统并统筹生态环境维护,并构成以生物多样性维护促进食物出产的可持续性,北京食物科学研讨院和我国食物杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在我国宁夏银川 一起举行“ 生态维护与食物可持续展开世界研讨会 ”。本届研讨会将环绕新资源食物发掘、动植物、微生物可代替蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要立异开展及存在的问题展开研讨,讨论未来食物展开方向,经过展现我国生态维护与食物可持续展开等范畴的最新科研成果,建立科研单位与企业产学研结合的渠道,一起促进我国食物工业展开快速踏入新路程。
Food Science of Animal Products(ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780)是一本世界同行评议、敞开获取的期刊,由北京食物科学研讨院、我国肉类食物归纳研讨中心主办,我国食物杂志社《食物科学》修改团队运营,归于食物科学与技能学科,旨在报导动物源食物范畴最新研讨成果,触及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等质料,研讨内容包含食物质料质量、加工特性,养分成分、活性物质与人类健康的联系,产品风味及感官特性,加工或烹饪中有害物质的操控,产品保鲜、储藏与包装,微生物及发酵,不合法药物残留及食物安全检测,实在性辨别,细胞培养肉,法规规范等。