老黄酶（OYE）可催化碳碳键构成反响，如不对称碳环化、α-溴酯的对映挑选性脱卤、光催化剂存鄙人的羰基复原、光激发下的α-氯酰胺的不对称自由基脱卤/环化和光诱导分子间自由基氢化反响。不同OYE催化的非天然反响有一个共同点：依靠外源电子复原黄素辅酶引发反响，其间来历于酿酒酵母的OYE2催化α-当归内酯（

  C=C键的酶异构化在自然界中广泛存在，依靠于多种蛋白质和相应的机制（计划1A），考虑到这些底物的替代方法，异构化反响不会产生立体中心。几种同源OYE可催化3-亚甲基二氢呋喃-2(3H)-酮产生异构化反响（计划1B1），且具有共同的催化机制：将黄素的氢搬运至碳碳双键以引发反响，导致方法分子内的氢搬迁，理论上只需要催化量的NAD(P)H。

  计划1. 生物催化C=C键异构化反响总述。A.酸碱催化和B.氢化物依靠机理

  为了判定用于不对称C=C键异构化反响的立体挑选性酶，近来，奥地利格拉茨大学的Mélanie Hall课题组将挑选作业扩展到未探明来历的OYEs上，该课题发现两个同源性较低（21%）的OYE催化1的异构化反响具有高的立体挑选性和立体互补性。作者解析了两种新的晶体结构，并经过浸泡试验和骤变研讨解析了其共同的催化机制：经过立体发散方法进行不对称的质子搬运（计划2）。

  计划2. 经过立体互补方法，同源OYE将α-当归内酯（1）立体挑选性地异构化为β-当归内酯（2）（来历：ACS Catal.）

  OYE催化1的异构化反响如下：将200−400 μg/mL（∼5−10 μM, 0.05−0.1 mol%）加入到含有10 mM1的Tris-HCl（50 mM）缓冲液中，助溶剂为2 vol% DMSO，在30 °C、250 rpm条件下反响过夜，成果如表1所示。在无NAD(P)H的情况下，2是仅有产品，手性GC显现萃取产品出现立体发散方法（计划2）：GsOYE催化1以高达88%的ee值生成(R)-2；而BfOYE4催化1以高达98%的ee值生成(S)-2。作者还挑选了在不同pH下，三种OYE催化产品的旋光度的差异（表2）。

  表2. rac-2在pH 9条件下与选定酶的“反向”异构化反响（来历：ACS Catal.）

  GsOYE与1的复合物晶体结构明晰地显现出其H174和N177的碳基与1之间的氢键（图1A），Y66和Y179的羟基都朝向1的前手性γ-碳，GsOYE中Y66和Y179分别对应于OYE2中的Y83和Y197。1与GsOYE晶体孵育7 h后，在酶活性位点检测到的电子密度首要为(R)型产品2，标明晶体内产生了立体挑选性异构化（图1B）。Y66尽管也挨近γ-碳原子，但在与Y179的羟基直接相互效果方面表现出更好的构型，两个Tyr氧原子之间的间隔为2.7 Å，比较之下，这个间隔在非挑选性异构酶OYE2中更大（Y83和Y197之间间隔为4.7 Å，图2）。

  图1. GsOYE与1构成合作物的时刻进程晶体学研讨。A）45分钟后，酶活性位点中首要化合物仍是1；B）7小时后，酶促反响产品(R)-2堆叠在FMN辅因子顶部（来历：ACS Catal.）

  来历于Propionibacterium acnes的多元不饱和脂肪酸异构酶（PAI）也是一种黄素依靠性酶，以不可逆方法催化亚油酸生成10,12-共轭亚油酸，经过FAD的N5攫取底物C11处氢原子引发反响，生成的碳阳离子B2 Int1 随后产生烯丙基异构，氢原子进攻B2 Int2 的C9位，导致分子内氢原子的搬迁并生成二烯产品（计划1B2）。

  图2. (R)-异构酶GsOYE（青色）和非挑选性异构酶OYE2（橙色）的结构叠加图（来历：ACS Catal.）

  根据对晶体结构的剖析，作者挑选几个或许发挥酸碱催化性质的氨基酸进行骤变，多个单骤变体被用于催化从1生成2的异构化反响和化合物3的复原反响。关于GsOYE，因T25坐落远离1的α-碳处（图1），故T25C对1的异构化反响无明显影响。N270、Y346、Y179和Y66均接近底物，骤变体对反响的影响如表3所示。各个氨基酸在1的异构化反响中所起的效果如计划3所示。浸泡试验标明Y179在GsOYE中似乎是作为C=C键Si面立体挑选性的质子供体。与Y179羟基构成氢键且与底物1较远的Y66参加了催化效果，但不参加底物的直接质子化。Y66或许经过传递质子参加Y179的再生（计划3A）。这就能够解说Y66F活性较低的现象，由于Y179在水环境中再生较慢，且经过该骤变体取得的产品具有较高的ee值。

  表3. 与野生型比较，GsOYE骤变体催化1生成(S)-2异构化反响和3的复原反响的影响（来历：ACS Catal.）

  计划3. 作者根据骤变研讨、晶体结构和浸泡试验提出的GsOYE和BfOYE4将1异构化为A）(R)-2和B）(S)-2的催化机制（来历：ACS Catal.）

  关于BfOYE4，骤变体对异构化反响的影响如表4。因无复合物晶体结构，故估测催化机理如下：（1）Y235使1的α-碳产生去质子化；（2）K157经过去质子化效果康复Y235的活性；（3）Y78立体挑选性地在C=C键的Re面使烯醇中间体从头质子化，即构成产品(S)-2（计划3B）。

  表4.与野生型比较，BfOYE4骤变体催化1生成(S)-2异构化反响和3的复原反响的影响（来历：ACS Catal.）

  总结：黄素依靠性老黄酶（OYEs）天然和稠浊的催化活性是经过电子搬运进程中复原黄素引发的。作为稀有的破例，两个非立体挑选性OYEs能够催化不依靠于氢的非活化C=C键产生异构化反响。作者报导了来历于海藻和真菌的立体互补老黄酶，其能够催化前手性模型底物γ-甲基β,γ-丁烯内酯以高达99% ee值异构化生成(R)-和(S)-对映体。根据新解析的两种晶体结构、浸泡试验和定点骤变，作者解析了部分非保存酪氨酸残基对(R)-和(S)-异构酶活性和立体挑选性的关键效果。这项研讨以共同的视角标明晰黄素蛋白在非氧化复原催化中的潜力，并为其在或许的立体发散类OYEs中寻觅烯烃异构酶供给了头绪。

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